技術(shù)文章
神經(jīng)精神病學(xué)研究中的重大挑戰(zhàn)之一便是開(kāi)發(fā)能準(zhǔn)確反映與情感障礙相關(guān)的癥狀的動(dòng)物模型。慢性社交挫敗應(yīng)激模型已被證明是研究抑郁癥的有效模型。在該模型中,C57BL/6J小鼠連續(xù)10天遭受CD-1小鼠攻擊,誘導(dǎo)其產(chǎn)生慢性社交挫敗應(yīng)激。本文描述了CD-1攻擊小鼠的篩選過(guò)程,C57BL/6J和CD-1攻擊小鼠之間的社交互動(dòng),以及作為抑郁樣行為指標(biāo)的社會(huì)回避評(píng)分的分析。
關(guān)鍵詞:社交挫敗,抑郁,慢性應(yīng)激,社會(huì)互動(dòng),小鼠模型
研究背景
抑郁癥是一種反復(fù)發(fā)作且危及生命的疾病,影響著全球約1.2億人。在神經(jīng)精神病學(xué)研究領(lǐng)域中,開(kāi)發(fā)有效的抑郁癥動(dòng)物模型至關(guān)重要,有效的動(dòng)物模型可幫助人類(lèi)理解抑郁癥背后的神經(jīng)和分子機(jī)制。目前,用于誘發(fā)小鼠的抑郁癥的各種慢性應(yīng)激包括:慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激,足部電刺激應(yīng)激,束縛應(yīng)激等,隨后可測(cè)量其快感缺失或絕望行為(如蔗糖偏愛(ài)測(cè)試,強(qiáng)迫游泳測(cè)試和懸尾測(cè)試),但這些慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁效果都不夠理想。與此同時(shí),慢性社交挫敗應(yīng)激由于其可靠性和可重復(fù)性,已被廣泛接受為抑郁癥的有效模型。社交挫敗范式已被證實(shí)為一種很好的抑郁模型,原因如下:1)易感小鼠的抑郁表型(社交回避、快感缺失、代謝變化等)可通過(guò)慢性抗抑郁藥物的治療而逆轉(zhuǎn),但急性給藥對(duì)其沒(méi)有效果。2)社交挫敗應(yīng)激產(chǎn)生易感表型和抗性表型可以用來(lái)解釋抑郁癥病理生理學(xué)中人類(lèi)應(yīng)激易感性的個(gè)體差異。3)由社交挫敗應(yīng)激引起的易感表型是長(zhǎng)期存在的,并伴隨著大腦獎(jiǎng)賞回路的遺傳和表觀遺傳變化。
材料和試劑
1、C57BL/6J小鼠(購(gòu)自Jeckson實(shí)驗(yàn)室):使用7-8周齡小鼠進(jìn)行社交挫敗造模(6-7周齡小鼠需要進(jìn)行一周的環(huán)境適應(yīng)期)
注:小鼠置于標(biāo)準(zhǔn)籠里,每個(gè)籠子限4-5只小鼠。
2、CD-1小鼠((Charles River實(shí)驗(yàn)室):將4-6個(gè)月大的雄性非繁殖鼠單獨(dú)飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)鼠籠內(nèi)。
注:社交挫敗范式使用受試小鼠的統(tǒng)一從屬關(guān)系作為社交應(yīng)激源,在本方案中采用了最常見(jiàn)的C57BL/6J:CD-1從屬關(guān)系。
清潔試劑(用于清潔場(chǎng)地和作為社交互動(dòng)場(chǎng)地/分隔器的樹(shù)脂玻璃):0.5%過(guò)氧化氫。
設(shè)備
1.透明鼠籠(帶墊料的一次性鼠籠)(Innovive,目錄編號(hào):RS1-H-C8)
2.標(biāo)準(zhǔn)水瓶(小鼠水瓶)(Innovive,目錄編號(hào):M-WB-300)
3.帶吸管的水瓶塞(氯丁橡膠塞)(Ancare,目錄編號(hào):OT-199-3")
4.圓筒支架(定制的塑料支架,可作為額外的水口;圖2B)
5.分隔器(定制的透明穿孔樹(shù)脂玻璃板;圖2B)
6.可拆卸外殼(定制的透明有機(jī)玻璃,頂部和底部均打開(kāi);圖3B)
7.秒表
8.露天試驗(yàn)室(定制,44(寬)x 44(長(zhǎng)) x 30(高);厘米)
9.社交互動(dòng)測(cè)試視頻跟蹤系統(tǒng)(如VisuTrack動(dòng)物行為分析軟件,CCD攝像機(jī)及計(jì)算機(jī))
實(shí)驗(yàn)流程
1、CD-1攻擊性小鼠的篩選
a.訂購(gòu)4-6個(gè)月大的雄性CD-1小鼠(至少多訂購(gòu)2-3倍,因?yàn)橹挥胁坏揭话氲腃D-1小鼠具有足夠的攻擊性)。CD-1小鼠單獨(dú)安置在標(biāo)準(zhǔn)鼠籠里,給予足夠的食物和水。并使CD-1小鼠在開(kāi)始篩選過(guò)程前適應(yīng)它們的新環(huán)境一周。
b.僅用于篩選CD-1小鼠的C57BL/6J雄性“篩選鼠"?!昂Y選鼠"的年齡范圍在8-20周,并可用于后續(xù)的篩選過(guò)程。在此過(guò)程中需要排除具有攻擊性的“篩選鼠"。
c.CD-1小鼠的篩選是在CD-1小鼠的籠子中進(jìn)行的。C57BL/6J“篩選鼠"直接放入CD-1小鼠籠中5 min。記錄每只CD-1小鼠的攻擊潛伏期,連續(xù)3天,每天一次,進(jìn)行三次篩選。
d.CD-1攻擊小鼠的篩選標(biāo)準(zhǔn):在三次篩選過(guò)程中,CD-1攻擊小鼠連續(xù)兩個(gè)階段初始攻擊潛伏期必須小于60秒,且必須連續(xù)攻擊C57BL/6J “篩選鼠"至少10秒。
e.CD-1攻擊小鼠在初始篩選后可使用3個(gè)月(CD-1攻擊性小鼠可能習(xí)慣社交挫敗過(guò)程,因此需要在下一次社交挫敗實(shí)驗(yàn)之前重新篩選)。
2、慢性社交挫敗應(yīng)激(圖1)
圖1|社交挫敗應(yīng)激造模和社交互動(dòng)測(cè)試的示意圖(慢性社交挫敗造模方案使用CD-1攻擊性小鼠執(zhí)行了連續(xù)10天的社交挫敗,然后進(jìn)行社交互動(dòng)測(cè)試和后續(xù)分析)
a.組裝社交挫敗籠(圖2A),取標(biāo)準(zhǔn)鼠籠,籠底部填充木片墊料。將穿孔的有機(jī)玻璃分隔板放置在籠子的中心。社交挫敗鼠被隔離出來(lái),并允許其在非社交挫敗區(qū)域內(nèi)進(jìn)行感官互動(dòng)。放置圓柱體(附加的水瓶架)在標(biāo)準(zhǔn)水瓶的對(duì)面。用圓筒支架插入組裝好的水瓶。確保鼠能飲用到水。將食物放在兩側(cè)的底部(水和食物應(yīng)隨意供應(yīng))。將標(biāo)準(zhǔn)鼠籠蓋牢固地放在鼠籠上。為期10天的社交挫敗方案至少需要10個(gè)帶有CD-1攻擊鼠的社交挫敗籠。
注意:分隔器應(yīng)裝配牢固,防止小鼠逃逸。
圖2|慢性社交挫敗應(yīng)激的標(biāo)準(zhǔn)籠(A.用于慢性社交挫敗應(yīng)激造模的標(biāo)準(zhǔn)鼠籠:CD-1攻擊小鼠被永-久安置在穿孔分隔器的一側(cè),而C57BL/6J小鼠每天在兩側(cè)交換位置,以防止對(duì)攻擊的習(xí)慣化。B. 標(biāo)準(zhǔn)鼠籠的附加部件尺寸(定制):在標(biāo)準(zhǔn)水瓶側(cè)的對(duì)面的圓筒支架裝有一個(gè)額外的水瓶。在非社交挫敗環(huán)節(jié)期間,穿孔的有機(jī)玻璃分隔器隔離兩種老鼠(允許感官互動(dòng)))。
b.在社交挫敗環(huán)節(jié)開(kāi)始前一晚,將CD-1攻擊鼠放置在已被分隔的鼠籠的一側(cè),使其適應(yīng)新環(huán)境。
注:首-選圓筒支架側(cè)。
c.在社交挫敗環(huán)節(jié)的第一天,將C57BL/6J小鼠直接放入CD-1攻擊小鼠同一側(cè)。在5-10 min的社交挫敗后(視頻源如下),將C57BL/6J鼠轉(zhuǎn)移到穿孔隔板的對(duì)側(cè),持續(xù)24小時(shí)。
注意:在社交挫敗環(huán)節(jié)開(kāi)始時(shí),將C57BL/6J鼠放在靠近CD-1攻擊鼠附近有助于啟動(dòng)其攻擊性行為??赏瑫r(shí)對(duì)10只受試小鼠進(jìn)行社交挫敗應(yīng)激。
d.對(duì)照組應(yīng)將C57BL/6J小鼠放置在一個(gè)相同的社交挫敗籠中,在穿孔有機(jī)玻璃分隔器的兩側(cè)各設(shè)置一只小鼠(將CD-1小鼠替換為C57BL/6J小鼠),持續(xù)10天,禁止任何身體接觸。這些小鼠同樣在隔板兩側(cè)轉(zhuǎn)換。
e.每只受試的C57BL/6J小鼠將每天面臨1只不同的CD-1小鼠,連續(xù)重復(fù)上述社交挫敗操作10天。
f.在最后一次社交挫敗之后,單獨(dú)飼養(yǎng)所有C57BL/6J小鼠。所有的CD-1攻擊性小鼠也都送回它們單獨(dú)飼養(yǎng)的籠子里,用于未來(lái)的社交挫敗實(shí)驗(yàn)(未來(lái)需要根據(jù)其攻擊性重新篩選)。
3、社交互動(dòng)測(cè)試
a.社交互動(dòng)測(cè)試在最后一次社交挫敗后24小時(shí)進(jìn)行。在社交互動(dòng)測(cè)試中,CD-1攻擊小鼠對(duì)于被測(cè)試的C57BL/6J小鼠應(yīng)該是完-全陌生的。在進(jìn)行社交互動(dòng)測(cè)試前,篩選CD-1攻擊性小鼠,以確保小鼠符合攻擊性標(biāo)準(zhǔn)。
b.社交互動(dòng)場(chǎng)地如圖3所示。配置視頻跟蹤系統(tǒng)(如VisuTrack軟件),通過(guò)跟蹤軟件自動(dòng)收集所有數(shù)據(jù)。
圖3|社交互動(dòng)測(cè)試場(chǎng)地的示意圖(A.社會(huì)互動(dòng)分析的區(qū)域劃分。B. 可拆卸的穿孔有機(jī)玻璃外殼,外殼內(nèi)部放入CD-1小鼠)
c.在與外部噪聲源和動(dòng)物隔離及紅光條件下,于社交互動(dòng)測(cè)試前先讓受試鼠適應(yīng)環(huán)境1小時(shí)。
d.在紅光條件下,每個(gè)社交互動(dòng)測(cè)試都由兩個(gè)2.5 min的階段組成。在第一階段,將社交挫敗模型小鼠放入社交互動(dòng)區(qū)域(在有機(jī)玻璃外殼對(duì)面的中心),并允許其在沒(méi)有CD-1小鼠的情況下自由探索。
注意:在第一階段比賽結(jié)束后,不要清理實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地。
e.在第一階段結(jié)束后,將模型鼠取回,直到第二階段。然后,將CD-1鼠標(biāo)直接放入有機(jī)玻璃外殼內(nèi)。
注意:將CD-1鼠從外殼頂部輕輕放下。
f.在第二階段,重新放入模型鼠,并讓它在CD-1小鼠存在的情況下自由移動(dòng)。
注意:在兩個(gè)階段之間以相同的方式放置模型鼠。
g.在每次測(cè)試結(jié)束時(shí)。使用清潔液清洗所有設(shè)備。
h.數(shù)據(jù)可以按照數(shù)據(jù)分析部分中的描述進(jìn)行分析。
數(shù)據(jù)分析
使用自動(dòng)視頻跟蹤系統(tǒng),可以從每個(gè)試驗(yàn)的視頻數(shù)據(jù)中計(jì)算出交互區(qū)和角落區(qū)的停留時(shí)間。在本研究中,對(duì)照組小鼠通常在互動(dòng)區(qū)花費(fèi)的時(shí)間更多,而模型鼠的社交互動(dòng)時(shí)間顯著減少(圖4)。因此,小鼠的社交能力可以通過(guò)比較在CD-1鼠的互動(dòng)區(qū)域內(nèi)的停留時(shí)間來(lái)量化。社交互動(dòng)比(SI ratio)計(jì)算方法如下:
注:Interaction zone time of "target" trial——CD-1攻擊鼠存在情況下,受試鼠在互動(dòng)區(qū)域內(nèi)停留時(shí)間;
Interaction zone time of "no target" trial——CD-1攻擊鼠不存在的情況下,受試鼠在互動(dòng)區(qū)域內(nèi)停留時(shí)間。
SI比值低于100%的小鼠被歸為抑郁易感小鼠,另一方面,SI比值超過(guò)100%的小鼠屬于抑郁抗性組。在大多數(shù)情況下,超過(guò)一半的C57BL/6J小鼠在受到慢性社交挫敗應(yīng)激時(shí)表現(xiàn)出易感表型。角落區(qū)停留時(shí)間是社交回避的另一個(gè)有用指標(biāo),它往往與互動(dòng)區(qū)停留時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(圖4B)。
圖4|社交互動(dòng)測(cè)試的統(tǒng)計(jì)分析
注意事項(xiàng)
1、針對(duì)社交挫敗應(yīng)激籠的設(shè)置可以有所不同,還可以根據(jù)籠的形狀和尺寸對(duì)分隔器、圓筒等附加設(shè)備進(jìn)行修改或替換。
2、社會(huì)挫敗持續(xù)時(shí)間(5-10 min)可以根據(jù)CD-1攻擊性小鼠的攻擊性來(lái)調(diào)整,以應(yīng)對(duì)適當(dāng)?shù)纳眢w壓力,避免造成嚴(yán)重傷害。仔細(xì)觀察每一個(gè)過(guò)程,替換那些攻擊性太強(qiáng)(持續(xù)留下開(kāi)放性傷口)或在社交挫敗過(guò)程中攻擊性不夠的CD-1小鼠。對(duì)嚴(yán)重受傷的社交挫敗鼠實(shí)施安-樂(lè)-死。
3、社會(huì)挫敗方案的變化:為了縮短應(yīng)激周期(例如與病毒表達(dá)周期相一致,如HSV)或減少對(duì)植入套管的損傷(例如光遺傳學(xué)),可以適當(dāng)縮短社會(huì)挫敗應(yīng)激范式的造模時(shí)間。
a.單次最大社交挫敗應(yīng)激方案(1天):將小鼠放入CD-1鼠的籠子中5分鐘,然后休息15分鐘;用新的CD-1鼠重復(fù)上述步驟至少兩次。
b.短期社交挫敗應(yīng)激方案(4~5天):造模小鼠每天經(jīng)歷兩次社交挫敗,持續(xù)4~5天。