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懸尾實驗(Tail suspension test, TST)是一種經(jīng)典而又能快速評價抗抑郁藥物、興奮藥物、鎮(zhèn)靜藥物藥效的方法。該動物模型將實驗動物的尾部進(jìn)行固定,使其頭部向下懸掛,動物在該環(huán)境中掙扎,企圖擺脫該困境,在經(jīng)過努力仍無法擺脫后,出現(xiàn)間斷性不動,顯示“行為絕望”狀態(tài)。實驗動物在該環(huán)境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫,從而提供了一個無可回避的壓迫環(huán)境,一段時間的實驗后,記錄處于該環(huán)境的動物產(chǎn)生絕望的不動狀態(tài)過程中的一系列參數(shù),動物的表現(xiàn)出的這種典型的“不動狀態(tài)”,反映了一種被稱之為“行為絕望狀態(tài)”,這種行為絕望模型與抑郁癥類似,而且對絕大多數(shù)抗抑郁藥物敏感,而且其藥效與臨床藥效顯著相關(guān),所以被廣泛用于抗抑郁藥物的初選。
懸尾裝置,醫(yī)用膠帶,VisuTrack攝像跟蹤系統(tǒng)以及分析軟件(上海欣軟)。推薦使用塑料懸尾實驗箱,尺寸通常為55cm高* 60cm*寬* 11.5cm深。為了防止動物之間的觀察或相互作用,實驗箱中間有一個擋板實驗動物隔開。同時保證每只動物的隔間足夠?qū)挸?,讓動物碰不到懸尾箱的箱壁。每個隔間的尺寸建議不低于:55cm高* 15cm*寬* 11.5cm深這個尺寸。小鼠的鼻子和實驗室箱子的地板之間的大致距離建議為20-25厘米。分析軟件推薦使用VisuTrack動物行為分析軟件,軟件可任意截取視頻,準(zhǔn)確性高。懸尾實驗與曠場實驗等測試不同,不應(yīng)該跟蹤動物的質(zhì)心/重心。VisuTrack動物行為分析軟件(上海欣軟)通過調(diào)查小鼠四肢的真實動作,實時分析小鼠搖擺(絕望狀態(tài))、掙扎行為等指標(biāo),自動存儲原始實驗視頻并可進(jìn)行分析,減少了人為誤差。
測試方法:
1) 將已在動物房適應(yīng)了三天的動物從SPF動物房中拉入實驗室。SPF級動物房應(yīng)設(shè)置的參數(shù)為室溫(22±2℃),濕度(40±20℃)%,12 h 晝夜交替燈光使動物有正常晝夜節(jié)律,實驗動物在此環(huán)境可自由攝取食物和水。
2) 將動物輕柔地從籠中拿出來,以最快的速度將其尾巴固定好,不得給小鼠造成多余的壓力和應(yīng)激狀態(tài)。具體操作為用醫(yī)用膠帶粘在距離尾巴尖-端 1 cm,以便將動物的尾巴從裝置懸掛桿上懸吊下來。動物尾巴尖-端與地面之間的高度約為 30 cm,使小鼠呈頭倒式位。
3) 攝像鏡頭需提前調(diào)好,將其調(diào)到水平對準(zhǔn)小鼠身體的位置,以便錄像可呈現(xiàn)完-全的視野。
4) 實驗總共需錄視頻 6 min,錄像記錄動物實驗期間的行為,但記錄后4min動物的不動時間。
5) 記錄時長完成后,撕去醫(yī)用膠布將實驗動物小心取下來,并放回原籠中做好記錄。
6) 所有動物測試完成后,及時清理儀器中的糞便和尿液。
主要的指標(biāo)及行為學(xué)意義:
1) 肢體不動:當(dāng)動物停止掙扎時,身體保持垂直倒懸狀態(tài),靜止不動,這個指標(biāo)可視為實驗動物出現(xiàn)習(xí)得性無助后放棄掙扎的行為表現(xiàn)。動物在懸尾實驗中的不動時間越長,表明動物的抑郁程度越重。
2) 掙扎行為:當(dāng)動物出現(xiàn)企圖掙扎、起身時的行為,動物的掙扎時間越短,表明動物的抑郁程度就更重。
數(shù)據(jù)如何統(tǒng)計:
記錄實驗動物的掙扎行為和不動時間,一般換算為以秒為單位的計量。通過與對照組進(jìn)行對比,一般使用T檢驗即可,至于是否選擇配對或未配對則需要跟自己的實驗?zāi)康膩磉x擇,此處不展開說明。
(測試時長、是否可重復(fù)、大小鼠的差異、品系)
1.膠帶要纏在接近動物尾巴尖-端的地方,不要纏在靠近尾巴根部的地方,這樣會影響動物的活動。若太靠下動物的掙扎與活動會受到限制,影響實驗結(jié)果。
2.背景板要與動物的顏色形成強烈反差,以便軟件識別,推薦使用白光背光板。例如用白色小鼠時,需要選用黑色的背景板,以便視頻錄制清晰,易分辨;反之亦然,用黑色的c57小鼠進(jìn)行實驗時,則需要考慮用白色的背景板來完成襯托和凸顯。
3.不同品種的小鼠懸尾實驗表現(xiàn)不同:例如空白對照組c57小鼠不動時間較長,均值多大于100s; 空白對照組的ICR 小鼠不動時間均值多小于100 s; 抑郁行為判斷標(biāo)準(zhǔn):不動時間與對照組相比有顯著性增加(P < 0. 05)即可,并不需要單純比較不動時長。
4.懸尾實驗并不建議用較重的大鼠,因為大鼠只能通過它們的尾巴來支持它們的體重,這對大鼠來說是痛苦的。同樣的道理,應(yīng)該注意避免使用異常重的小鼠(例如用于模擬肥胖的小鼠),在這種情況下,實驗者應(yīng)該尋找替代性的測試,例如強迫游泳實驗。
5.動物從飼養(yǎng)環(huán)境帶入實驗環(huán)境應(yīng)適應(yīng)一段時間,通常至少一個小時以上。
6.實驗環(huán)境應(yīng)保持安靜,突然大或者一直持續(xù)的噪音會使實驗動物驚慌失措。
7.小鼠懸尾實驗持續(xù)時間通常為6分鐘。與強迫游泳實驗不同,小鼠在實驗初期更容易表現(xiàn)出不動。
8. 底部建議放置一個可拆卸的拖盤,收集糞便或尿液。
9. 懸掛后動物鼻尖與設(shè)備地板之前的參考距離在 20~25 cm 左右。
10.短時間不建議將此實驗重復(fù)第二遍,以免對實驗動物的心理狀態(tài)產(chǎn)生影響。
11.測試中,前肢只有小鼠運動,后肢不動,可視為動物的絕望狀態(tài)。
12.由于運動的慣性,小鼠的鐘擺式活動也需要視為動物的絕望狀態(tài)。
13.懸尾與強迫游泳實驗相比,該實驗沒有因浸泡在水中而導(dǎo)致體溫降低的風(fēng)險。這兩個實驗在靈敏度和性能上有各種重要的差異,一個實驗的結(jié)果可能無法在另一個實驗中重復(fù),故應(yīng)理性看待實驗結(jié)果。
14.懸掛用的膠帶應(yīng)牢固地粘貼在小鼠尾部和懸掛桿上,并且足夠堅固以承受正在測試的小鼠的重量。但是,膠帶不應(yīng)該過于粘滯應(yīng)保證既可以順利固定動物,又不至于在實驗結(jié)束后難以從實驗動物尾部移除,膠帶尺寸可盡量統(tǒng)一。
15.實驗結(jié)束后(通常是 6 分鐘),將動物放回鼠籠,應(yīng)輕輕將膠帶從尾巴上拉下來,不要從尾巴上撕扯膠帶,避免給動物帶來痛苦。
16.清潔用品,每次實驗完成,收集糞便和尿液,徹-底擦拭懸掛盒等儀器設(shè)備。
17.在實驗前幾天和后幾天推薦測試動物的行動能力,如自發(fā)活動等。目的是為了排除動物自身運動能力的影響,而更加說明是動物的抑郁程度不同而產(chǎn)生不動或掙扎樣行為。
18.本實驗在短期內(nèi)不建議重復(fù),若必須重復(fù)一般建議兩次實驗間隔半個月以上。
19.若是多只動物同一時間段做實驗,則需要注意每只動物的間隔,以及動物與動物之間需要用不透明的擋板隔開,防止出現(xiàn)干擾。
懸尾實驗步驟簡單,時間短,在一段時間內(nèi)出數(shù)據(jù)的效率很高。比起強迫游泳,關(guān)于溫度沒有什么太需要注意的地方,但一定要注重動物福利的落實和準(zhǔn)確識別不動狀態(tài),做到識準(zhǔn)、記準(zhǔn)。
進(jìn)一步探討與展望:
懸尾試驗非常適合測量引起急性抑郁癥。各種類型的抗抑郁藥物,例如三環(huán)類藥物、選擇性血清素再攝取抑制劑 (SSRI) 和單胺氧化酶抑制劑 (MAOI)、精神興-奮-劑、精神安定藥、抗焦慮藥等,都已使用懸尾試驗進(jìn)行了測試,該模型和強迫游泳模型一樣可靠,在抑郁等藥物評價體系中占有不可替代的位置。