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大小鼠條件性恐懼實(shí)驗(yàn)測試方法總結(jié)(精華篇)

更新時(shí)間:2023-11-21       點(diǎn)擊次數(shù):1359

概述

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經(jīng)典條件性恐懼,是評估恐懼學(xué)習(xí)和記憶的可靠模型。在條件性恐懼期間,動物學(xué)會將先前的非威脅性刺激(指-定為條件刺激或CS)與先天有害刺激(指-定為非條件刺激或US)聯(lián)系起來。如果這種CS-US關(guān)聯(lián)被成功學(xué)習(xí)和記住,先前中性的CS本身將成為US的預(yù)測因子,從而引發(fā)原來US觸發(fā)的恐懼反應(yīng)(指-定為條件反應(yīng)或CR)。另外,在此過程中,動物還會學(xué)習(xí)到情境與US的關(guān)聯(lián)。

 

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

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條件性恐懼實(shí)驗(yàn)設(shè)備的主要和基本組成部分是:條件性恐懼測試室、隔音通風(fēng)箱和控制軟件。測試室具有導(dǎo)電格柵的地板、電擊發(fā)生器以及紅外探測器,測試室通常由透明有機(jī)玻璃制成,可將小鼠的嵌套在大鼠的測試室中。其實(shí)大鼠尺寸的測試室也可以用于小鼠。為了防止動物在受到厭惡刺激時(shí)會跳出測試室,強(qiáng)烈建議測試室設(shè)置為有頂蓋的。測試室放置在隔音箱中,隔音箱配備有一個照明燈、一個小風(fēng)扇、聲音發(fā)生器以及一個與聲音發(fā)生器相聯(lián)的擴(kuò)音器、攝像機(jī)和錄音設(shè)備。風(fēng)扇用于通風(fēng)和產(chǎn)生背景噪音,這對于以聲音作為CS的情況尤其重要。不同刺激的呈現(xiàn)由具有相應(yīng)軟件的計(jì)算機(jī)控制。

圖片VisuFcs條件性恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),型號:XR-XC404,上海欣軟

動物的行為通常由安裝在頂部的攝像機(jī)或位于測試室周圍框架中的紅外傳感器記錄。視頻記錄或來自紅外傳感器的信號可以使用指-定的軟件自動分析。另一種選擇是在事件記錄器軟件的幫助下人工分析視頻記錄。其他組件包括用于改變測試環(huán)境外觀的備用地板和墻板等。特定的測試室尺寸可能會有所不同,但是它們必須適合動物(例如,格柵地板間距對大鼠來說更寬),并允許自由移動和探索。對于聽覺條件恐懼范式,可以安裝一個動物不可見的LED指示燈在測試小室內(nèi),可以用于在沒有音軌的視頻記錄上指示聲音刺激的呈現(xiàn)。

 

實(shí)驗(yàn)動物

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1、由于跨物種恐懼環(huán)路的保守性,所有品系的實(shí)驗(yàn)室大鼠和小鼠都可用于經(jīng)典的條件性恐懼范式。一般來說,條件性恐懼行為測試的一個重要考慮因素是嚙齒動物在實(shí)驗(yàn)時(shí)的年齡。條件性恐懼反射可以在任何年齡的動物身上建立,然而,在非常年幼和青少年的動物中,學(xué)習(xí)和記憶表型與成年動物有很大的不同。對于學(xué)習(xí)和記憶能力缺陷或增強(qiáng)的一般表型,一般使用成年動物(通常周齡在8至16周之間)

2、從實(shí)驗(yàn)動物供應(yīng)商處訂購進(jìn)入設(shè)施的動物應(yīng)被允許適應(yīng)新的飼養(yǎng)條件一周或更長時(shí)間。

3、實(shí)驗(yàn)動物應(yīng)飼養(yǎng)在光照、溫度和潛在應(yīng)激源(如籠子變化、同籠數(shù)量或其他干擾)的統(tǒng)一條件下。

4、除非情況要求單籠飼養(yǎng)(如手術(shù)后的動物或具有高度攻擊性的動物),否則不應(yīng)單獨(dú)飼養(yǎng)嚙齒動物,因?yàn)檫@可能會對行為結(jié)果產(chǎn)生不利影響。大鼠通常每個籠子飼養(yǎng)兩到三只,而每個籠子最多可以飼養(yǎng)五只小鼠。對于具有攻擊性的小鼠品系,例如C57BL/6小鼠,每籠飼養(yǎng)的雄性小鼠少于5只可能是最佳的。

5、每個實(shí)驗(yàn)組所需的動物數(shù)量應(yīng)通過功效分析確定。通常一般情況下7-10只大鼠或10-15只小鼠可以提供足夠的統(tǒng)計(jì)功效。

 

關(guān)鍵參數(shù)

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1. CS

在經(jīng)典條件性恐懼實(shí)驗(yàn)中,CS幾乎可以是任何離散的非威脅性線索,例如聲音,光線或氣味。在聽覺條件性恐懼中,常用的CS是一種使用單一頻率音調(diào)的中性非有害聲音, 例如,2-10 kHz范圍內(nèi)的聽覺刺激,其強(qiáng)度約為80 dB。CS呈現(xiàn)的持續(xù)時(shí)間因研究而異,范圍從2 s到30 s不等。

2. US

US是有害的或輕度疼痛的。最-常-用的US是輕度電擊,電刺激的優(yōu)點(diǎn)是它們的參數(shù)定明確,并且易于控制和管理。如果對動物的腳施加電刺激,它們也被稱為“足部電擊”。電刺激的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間不同,強(qiáng)度可能在 0.4 至 1 mA之間變化,持續(xù)時(shí)間通常為 0.5 s至 2 s 之間。

3. 跟蹤配對刺激

當(dāng) CS 和 US 在整個測試中重復(fù)出現(xiàn)但兩者不是同時(shí)出現(xiàn)時(shí),稱為跟蹤配對刺激(圖1)。US通常在CS呈現(xiàn)結(jié)束后的相對較短的固定時(shí)間間隔內(nèi)出現(xiàn),一般約10 - 20 s,但足以在CS和US之間形成聯(lián)系。但是幾個CS-US配對之間時(shí)間間隔要長一些,大約2.5 - 4.5 min。

4. 延遲配對刺激

當(dāng)US與CS的呈現(xiàn)共同終止(即,電擊在CS結(jié)束時(shí)精確地傳遞),這被稱為延遲配對刺激(圖1)。在正常情況下,條件反應(yīng)在延遲配對刺激處理中比在跟蹤配對刺激中更強(qiáng),因?yàn)镃S-US配對在時(shí)間上更緊密地聯(lián)系在一起。跟蹤配對刺激激活海馬,而延遲配對刺激主要激活杏仁核。因此,選擇哪種范式將取決于所要解決的科學(xué)問題。

圖片圖 1:跟蹤配對刺激與延遲配對刺激條件性恐懼的示意圖

 

實(shí)驗(yàn)程序(測試方法)

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1、線索條件性恐懼測試cued fear conditioning

2情境條件性恐懼測試

3、恐懼增強(qiáng)性驚嚇

4條件性恐懼記憶的消退

 

 

凍結(jié)時(shí)間通常表示為 CS 持續(xù)時(shí)間的百分比,并在每次測試中取平均值。例如,如果一只動物在30秒的長CS呈現(xiàn)過程中凍結(jié)了24秒,就代表它在該試驗(yàn)中顯示出80%的凍結(jié)反應(yīng)。評價(jià)情境恐懼時(shí),可以使用凍結(jié)時(shí)間占整個測試持續(xù)時(shí)間百分比作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。對于消退測試應(yīng)測試中的每個CS進(jìn)行單獨(dú)分析,而不是取平均值,因?yàn)閮鼋Y(jié)行為會逐漸減少。如果CS呈現(xiàn)數(shù)量非常多,單獨(dú)分析每個CS下的凍結(jié)行為導(dǎo)致曲線非常雜亂,則可以將連續(xù)幾個(2-5CS作為一個試驗(yàn)塊,將每個試驗(yàn)塊的數(shù)據(jù)平均,這可能有助于簡化曲線。在情境恐懼消退的情況下,可以將測試分解為例如 1 或 分鐘的間隔,以評估恐懼消退的獲得。另一個不太常用的參數(shù)是凍結(jié)行為次數(shù),以總數(shù)表示。

驚嚇反應(yīng)顯示出一定程度的個體內(nèi)和個體間變異性,因此需要進(jìn)行較多試驗(yàn),并且推薦匹配方式分組,即根據(jù)基線驚嚇反應(yīng)將小鼠或大鼠分配到實(shí)驗(yàn)組和對照組,以確保在實(shí)際實(shí)驗(yàn)開始之前組均值彼此之間沒有差異。除了恐懼CS 驚嚇刺激試驗(yàn)外,還包含單獨(dú)的驚嚇刺激試驗(yàn)。對單獨(dú)驚嚇“CS驚嚇的平均反應(yīng)的差異稱為恐懼增強(qiáng),以絕對值或單獨(dú)驚嚇幅度的百分比變化表示。

通常建議不要只分析條件性恐懼的單一測量,特別是如果使用的設(shè)置和/方案允許測試更多的恐懼反應(yīng)。例如,動物可以將恐懼反應(yīng)從凍結(jié)行為轉(zhuǎn)換為逃反應(yīng)。這種逃跑反應(yīng)也可以通過跟蹤軟件中的速度閾值自動檢測。如果不知道逃跑反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中增加,那么在這個實(shí)驗(yàn)中觀察到凍結(jié)減少將被錯誤地解釋為恐懼減少。

 

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